2004年19卷2期
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为了研究白细胞介素-18(IL-18)基因对人免疫缺陷病毒(HIV-1)核酸疫苗诱导免疫应答的影响，将人IL-18基因插入到真核表达载体pVAX1中，构建了真核表达载体pVAX1-IL-18；将pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18或者pCI-neoGAG单独免疫Balb/c小鼠，检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ，同时观察免疫小鼠脾淋巴细胞增殖和小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。酶切及测序结果表明成功地构建了人IL-18基因真核表达载体；与pCI-neoGAG免疫组比较，pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠血清的抗HIV-1p24抗体滴度降低（P0.01）；而与pCI-neoGAG免疫组比较，pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠血清的IFN-γ升高（P0.01）；pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数（SI）以及特异性CTL 活性均高于pCI-neoGAG免疫组（P0.01）。IL-18基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠，可能增强特异性Th1细胞和CTL反应，白细胞介素-18基因对体液免疫有抑制作用。
乙肝核心抗原（HBcAg）蛋白基因(C基因)在酿酒酵母中表达，表达产物经过分离和Sepharose CL-4B柱子的初步纯化。产物经SDS-PAGE和Western blotting鉴定为一分子量约21.5kDa的多肽。再经蔗糖密度梯度超离心和CsCl等密度梯度超离心等过程而被纯化。分管收集的超离心纯化产物经ELISA抗原活性检测和密度分析，可知ELISA反应强度较高的收集管中的颗粒密度主要分布在1.27g/mL和1.40 g/mL两个峰值处。将rHBcAg抗原活性最高的收集管合并，再经TEM观察，发现酵母表达的rHBcAg蛋白（核心蛋白）能自主装配成大小不同的两种核心颗粒，大颗粒直径约为30.1±2.4 nm，小颗粒直径约为21.5±3.3 nm。这表明，酿酒酵母表达的rHBcAg颗粒具有大小不同的二态性，其生物学意义还未明了，需进一步研究和探讨。
为了检测表达CD40L的质粒能否作为核酸疫苗佐剂提高A/PR8/34流感病毒血凝素（HA）DNA疫苗的免疫应答，构建了表达鼠CD40L的质粒，并将它与A型流感病毒的 HA DNA疫苗用电击的方法共同免疫BALB/C小鼠（各30g），免疫两次，间隔三周，第二次免疫后1周，用致死量流感病毒A/PR8/34攻击。发现与单独免疫30g HA相比，血清中抗HA的IgG抗体量明显提高，且以IgG2a抗体提高为主，小鼠体重减轻非常少且体重恢复加快。实验结果显示，CD40L能作为流感病毒核酸疫苗佐剂，提高小鼠抗流感病毒攻击的能力。
将分别携带SHIV-KB9 (SIV/HIV-1 KB9) 基因组的3′端和5′端的两个半长克隆，体外连接成SHIV-KB9全基因组克隆。含有全长基因的质粒培养时易发生同源重组和缺失，采用JM109作为宿主菌以及30℃、低转速的培养条件，可保持质粒的稳定性。通过PCR , RT-PCR 和猴免疫缺陷病毒(SIV) gag p27 核心抗原滴度检测表明：感染性克隆SHIV-KB9可有效在人、恒河猴及食蟹猴的外周血单核细胞中复制。
从伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA中扩增到3.76 kb的基因组片段，该片段包含UL31、UL32、UL33和UL34基因完整编码区，以及UL30和UL35基因部分序列。UL31、UL32、UL33和UL34基因G+C含量为69.5%~73.4%，偏向于使用富含GC特别是第三密码子位置上核苷酸是C或G的密码子，Ala、Leu、Arg的利用率最高，占氨基酸残基总数的36.4%。PRV Ea株UL31和UL32基因与PRV Ka株核苷酸与氨基酸序列同源性都很高，在98%以上；而UL33和UL34基因与Ka株的氨基酸序列同源性较低，分别为95.7%和94.8%。UL31基因在疱疹病毒α-亚科所有成员之间都很保守，并且UL31基因与马疱疹病毒IV型同源程度最高。UL32、UL33和UL34基因均与牛疱疹病毒I型同源程度最高。UL31、UL32、UL33与UL34基因产物均有酪蛋白激酶2磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点，表明UL31、UL32、UL33、UL34蛋白质可能都是磷酸化蛋白质。
通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有O型口蹄疫病毒P1-2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体。首先将P1-2A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle-CMV上，再将重组穿梭质粒用PmeI线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态菌，经细菌内同源重组产生pAdcmv-p12x3c和pAdcmv-p12x3cd重组腺病毒质粒，经序列测定证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体中。重组腺病毒质粒经PacI线性化后转染HEK293细胞，转染1w内细胞出现典型病变。取转染细胞裂解液上清连续传代至第4代时，细胞于24~48h内即病变完全，收取接毒后24h细胞进行PCR和RT-PCR检测，表明目的基因已整合到腺病毒基因组内，且在mRNA水平上有表达。取第4、6、8和10代病毒，用蛋白酶K处理后可扩增出目的基因，证明此重组病毒可稳定存在。本研究为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。
以牛泡沫病毒(Bovine foamy virus, BFV)中国株BFV3026原病毒DNA为材料，构建R区系列缺失质粒， 通过对其转染细胞中RT水平及对缺失质粒与luc报告质粒共转染细胞中萤火虫荧光素酶活性的测定，确立U5区对于BFV3026两类启动子LTR和IP均具有负调控作用；同时将带有不同R区的BFV3026结构基因片段克隆于异源启动子CMV之下，通过对其转染细胞293T中RT酶活性的测定，确立R区对于病毒结构基因pol的表达具有一定的调节作用，并将其功能区域初步界定在R区5′端100bp内。
参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的基因序列，设计合成一对引物，对绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）内蒙株的gag基因中主要编码CA蛋白的基因段进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳分析，呈现一条约897bp的特异条带，将其回收后克隆入pMD-18 T载体中，并进行序列测定与分析。结果表明，与南非株（基因序列号NC-001494）的gag基因序列比较，核苷酸同源性为83%，推导出的氨基酸同源性为84%。与美国株（基因序列号AF105220）的gag基因序列比较，核苷酸同源性为81.5%，氨基酸同源性为83%。这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的一段序列，为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础。
根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)主要衣壳蛋白（Major Capsid protein, MCP）基因（mcp）序列设计引物，PCR扩增得到一长约1400bp的DNA片段， 将其克隆到pGEM-T Easy Vector。氨基酸亲水性分析表明，在150-250位氨基酸之间亲水性很高，可构成主要抗原决定簇及形成跨膜区。mcp基因经PCR改造后克隆至原核表达载体pBV220，构建表达MCP的大肠杆菌基因工程菌，该工程菌经42℃诱导，SDS-PAGE检测，在约50kDa处有一特异蛋白带，含量约为菌体总蛋白的23%。用纯化和复性后的蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清，Western-blotting分析显示，重组MCP制备的抗血清能与ISKNV MCP特异结合，说明表达产物具有与ISKNV MCP相似的抗原特性。
将含重组白细胞介素12（hIL-12）的杆状病毒（Ac-hIL12）经空斑纯化后，在草地贪夜蛾Sf9细胞中进行连续无稀释传代到P55代，收集被P15、P25、P35、P45、P55代重组病毒感染的细胞，抽提胞内病毒（ICV）DNA。根据重组病毒构建的原理，在P35 cDNA和P40 cDNA的3末段设计一对引物进行PCR，扩增出了包括P35 cDNA、Polyhedrin启动子、P10启动子和P40 cDNA序列在内的全长约2.0kb片段，克隆至T Vector进行序列测定后发现，在第P15、P25和P35代所扩增出的序列没有发生任何突变。但在P45代，P35cDNA中就有3个碱基发生了点突变（461T→C，517A→G以及630C→T），Polyhedrin启动子的+1位后插入了一个碱基T，P40 cDNA与P10启动子区（230bp）没有变化；而第P55代除了以上碱基突变以外，P10启动子区-168位的G替换突变为T， -136与-135位之间插入一个碱基T，以及-122位缺失一个碱基T。以上结果表明杆状病毒在体外细胞连续传代过程中可导致外源基因本身的突变。
通过农杆菌介导将水稻草矮病毒（Rice grassy stunt virus, RGSV）编码病害特异蛋白基因sp导入台农67及中花6号品种。经过筛选，再生，获得转化植株。PCR及Southern点杂交分析结果初步表明目的基因片段整合到水稻基因组中。RT-PCR Southern点杂交结果表明目的片段已在植株体内进行了转录。
根据已报道的建兰花叶病毒（CyMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）基因组核苷酸序列，在其cp基因上下游设计PCR引物。CyMV预计扩增产物784bp，ORSV预计扩增产物604bp。以采集自广东省顺德的墨兰和文心兰表现病毒病症状的病株叶组织总RNA为模板，进行RT-PCR扩增。对预期大小的5个扩增产物进行克隆和测序，结果表明，来源于不同兰种或同一兰种不同兰场的病样CyMV引物扩增产物核苷酸序列存在少量差异，但均与世界各地的CyMV分离物cp基因高度同源；而来源于不同兰种的病样ORSV引物扩增产物核苷酸序列完全相同，与世界各地的ORSV分离物cp基因高度同源。因此可将侵染广东兰花的两种病毒鉴定为CyMV和ORSV。混合上述两种病毒的 PCR引物，采用双重RT-PCR扩增，对采自广东顺德23个兰场共153份样品进行病毒检测，76 份（49.7%）检出CyMV，52份（34.0%）检出ORSV，2份（1.3%）同时检出CyMV和ORSV。
根据水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）侵染玉米（Zea mays L.）的症状发展过程先后取叶脉做超薄切片，在透射电镜下观察病毒在细胞内的侵染状态，并在取样前用灰飞虱无毒若虫进行饲毒和传毒试验。结果显示RBSDV侵入玉米叶细胞后先出现在细胞壁附近，个别粒子似与胞间连丝相连；细胞质内产生病毒基质，病毒粒子先增殖并分布其周边，后向病毒基质内扩展；当病毒粒子布满病毒基质后在细胞质中出现直径约90nm的管状结构，病毒成串排列在该管状结构中；随后管状结构逐渐消失，最终形成晶格状聚集排列。用灰飞虱无毒若虫在细胞内病毒基质出现和病毒增殖期饲毒的，到成虫时分别有2.93%和7.83%个体传毒率；在细胞内病毒成串分布于管状结构和晶格状聚集排列期饲毒的，到成虫时均不能传毒。
朊病毒是一种全新类型的致病因子，以一种全新的致病机制造成许多神经退化性疾病。它的致病性主要由于PrPC向PrPSc构象转变而造成。为了探讨PrPC向PrPSc转变过程中PrP分子构象变化的机制, 我们计算分析了人天然PrP分子及不同的单残基突变体（如M166V，S170N，E200K和R220K）的氨基酸残基溶剂可及性, 并对天然PrP分子及其突变体进行了结构重叠模拟和RMS偏量分析。结果表明：由于166位等单个残基的突变, 造成PrP突变体与天然蛋白的局部结构出现较大差别, 使得部分残基的溶剂可及表面积发生了较大变化, 并且部分残基改变了它们的位置, 同时也影响蛋白质表面的电荷分布, 这些改变是为了更好地适应次级相互作用的局部环境。分析表明PrP与一般球蛋白在性质上有一定的差异, 说明PrP分子并不是一种稳定的球蛋白结构, 只是一种折叠中间物。
分别在不同pH、含有不同金属阳离子及腐殖酸的脱氯自来水与蒸馏水中，研究了砂与金属氢氧化物修饰砂吸附与去除Polivirus 1（PV1）和Bacteroides fragilis phage（B.fp）的不同效果。结果显示，天然砂吸附病毒效率随水体pH的降低而增加，但当砂表面经氢氧化铝、氢氧化铁沉积修饰后，却在中性pH具有较高的吸附率。金属阳离子可促进天然砂吸附病毒，并随其浓度和价态的增加而增加，但对修饰砂作用不明显。腐殖酸对砂及修饰砂吸附病毒的影响也不同，修饰砂吸附病毒不受腐殖酸的存在及其浓度影响，而天然砂会因腐殖酸的存在及其浓度的提高而降低吸附病毒效率。在任一实验条件下，砂与修饰砂在自来水中的吸附病毒效率高于在蒸馏水中的吸附效率，扫描电镜观察显示砂与修饰砂具有明显不同的表面结构特征，这是两者具有不同吸附效率的基础。从 砂与修饰砂吸附PV1的效率高于B.fp的现象说明B.fp是一个更为合适的病毒去除指示生物。本实验结果表明了金属氢氧化物修饰砂可为传统的净水工艺提供高效的病毒去除过滤介质与途径。
BLCAP is a potential gene for suppression of cervical carcinoma, which was found by analysing the cervical carcinoma specimen with the oncogene and anti-oncogene cDNA microarray. Basing on the bioinformatical analyses, we try to predict the function of blcap gene. The results show that there are several genes that highly resemble with blcap. The comparability between the sequences of blcap and Homo sapiens mRNA (DKFZp564M053) or BC10 is 99% and 87%, respectively. The protein encoded by BLCAP is composed of Leu(19.5%)、pro(9.19%)、ser(8.04%)、cys(8.04%) and other amino acids. The secondary structure of the N-terminal of BLCAP encoded protein is an alpha helix. In the C-terminal, it is beta sheet and in the middle, it is coil. The of the terminals is more hydrophobile than the middle region. Between 45-55aa, there is a transmembrane region. Therefore, we forecast the BLCAP is a member of transmembrane protein I. By analyzing the signal peptide and the procedure of blcap gene with the program of SignalP (V1.1), we found a cleavage site in 59-66aa. By using the program of Netpho, we predicted there might be three phospholate sites at 68aa, 73aa and 78aa. At 78-81aa, we found a typical [ST]-X（2）-[DE] structure—the phospholate site of tyrosine protein kinase, which might be related to its function. Bioinformatic studies of blcap provided the foundation for the function researches of BLCAP in laboratory.
Full E2 gene fragment of Classical swine fever virus (CSFV)shimen strain was amplified by RT-PCR method, then a specific fraction -the A, D antigenic domains- , which encodes protein with good antigenicity and suitable for being expressed in E. coli with high level, was amplified respectively by 2 different pair of primers. Then the 2 amplified fragments were tandemly linked and inserted into prokaryotic expressing vector pET-32a to obtain the plasmid pET-2e. The SDS-PAGE assay showed that although the proteins were present in the form of inclusion body, the linked proteins were expressed from plasmid pET-2e as expected, and can be expressed with high level when induced with IPTG.Western-blotting showed good antigenicity of the target protein.
Two pairs of primers were designed according to the N gene sequence of PEDV-CV777 strain in Genebank (No. AF353511). PCR amplification product of outer-primers was 1328bp, and the inter-primers amplification product was 538bp. With the primers, a nested PCR assay was established to detect PEDV. This method was sensitive and specific and could be used in PEDV diagnosis and epidemiological investigation.
To study the distribution characteristics of Hepatitis B virus (HBV) genotypes in groups of the Zhuang nationality of Baishe in Guangxi, the PCR sandwich hybridization-ELISA technique was used to determine the genotypes in 30 patinets of Zhuang nationality with hepatitis B. Geontype B, C, D and non A~F were found in this group, in which 56.6% of them were type D,46.6% type C,33.3% typeA~F, 20% type B, Most patients were found with types C+D, D+B or C+B. It is suggested that there are genotypes D, C, B and non A~F in this area, and the major one was genotype D. There are mixture of genotypes C+D, B+C, D+B in this region, so the HBV genotype might be associated with area and nationality.
Clone N3 and C from Human immunodeficiency virus(HIV) gp41 gene were expressed using the pET expression system. When induced by IPTG at 37℃, both two clones did not express in E.coli BL21(DE)3. Howerver, when induced at 16℃, the two clones were both overexpressed, and the amount of the product was about 20% of the total bacteria protein. In Western blotting test, the protein product could react with HIV-positive serum. After IPTG induction, E. coli cells had much higher death rate at 37℃ than at 16℃; [3H]uridine release assay also showed that after IPTG induction, E. coli had a higher release at 37℃. The results suggested that overexpression of the two proteins was due to their decreased toxicity at lower temperature.
39卷第1期 (2024年2月)
ISSN 1674-0769
EISSN 1995-820X
CN 42-1760/Q
主编: 石正丽
影响因子: 5.5*
*源于2022年JCR
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