2004年19卷3期
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根据SARS-CoV sars7a基因设计并化学合成部分重叠引物，经二轮PCR获得sars7a基因片段，以此片段为模板并利用一对带有Kozak序列及删除终止密码的引物进行PCR，获得产物与pEGFP-N1载体连接，使sars7a基因位于EGFP的基因上游，得到含编码Sars7a-EGFP融合蛋白基因的哺乳动物细胞表达载体。采用细胞核转染技术将重组表达载体转染K562细胞，以流式细胞仪和共聚焦显微镜分析，可检测到EGFP的绿色荧光，表明Sars7a-EGFP得到表达，该蛋白分布于整个细胞，提示Sars7a并非膜蛋白，更可能是胞浆蛋白。此外，该蛋白的表达对K562细胞凋亡无明显影响。
本研究旨在以HCV为平台，在简化RT-PCR基础上，结合体外转录，建立一种特异、高效、简便的检测血清中HCV RNA的体外转录合成系统。本法扩增终产物为特定极性的ssRNA，其特异性经凝胶电泳和斑点杂交确定；RNA定量分析结果显示本法核酸扩增效率高于巢式PCR近20倍。
本文利用差速离心方法提纯的登革2型病毒、抗登革病毒单抗、病毒受体、耦合有G蛋白的琼脂糖珠之间特异性结合的作用，利用免疫共沉淀方法从C6/36细胞中分离鉴定出分子量约为35kDa受体蛋白；并用糖蛋白染色方法否定了此蛋白的糖基化特征。
采用分子克隆技术，构建E7变异株重组质粒[pcDNA3.1-(by)E7]和E7标准株重组质粒[pcDNA3.1-(ys)- E7]，并将两种质粒分别皮下免疫Balb/c小鼠，免疫后于不同时间提取小鼠血清和制备脾淋巴细胞悬液，分别用ELISA法和MTT比色法检测特异性抗体和特异性淋巴细胞增殖反应。基因免疫后，ELISA法显示，HPV16 E7变异株和标准株均能诱导特异性抗E7抗体；MTT比色法显示，E7标准株免疫组脾淋巴细胞在体外受到变异株E7蛋白的再次刺激后出现特异性淋巴细胞增殖反应，变异株E7免疫组脾淋巴细胞经过同样处理后，出现非特异性淋巴细胞增殖反应。结果表明HPV16 E7变异株能诱导特异性体液免疫应答而不能诱导特异性细胞免疫应答，HPV16 E7变异株无论在结构还是免疫原性上均与标准株有差异。由此推测，HPV16E7变异可能导致其逃逸机体自然感染或疫苗诱导的免疫应答。用基因免疫方法研究E7变异株免疫原性也为其它不能或难以进行体外培养的病毒变异研究提供借鉴。
为了研究利用腺病毒载体表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1、G2的可行性及免疫原性。通过克隆76-118株G1、G2基因至腺病毒表达载体pAdTrackCMV, 得到阳性克隆pAdTrackCMV-G1、G2。PmeI线性化的阳性克隆与腺病毒骨架载体pAdeasy-1共转化BJ5183宿主菌，经同源重组后得到重组病毒rAdeasy-G1、rAdeasy-G2。重组病毒经PacI线性化后，脂质体介导转染293细胞，使重组病毒得到扩增。将重组病毒免疫Balb/c小鼠，并通过ELISA和间接免疫荧光对免疫小鼠血清进行了分析。结果表明，rAdeasy-G1组六只免疫小鼠、rAdeasy-G2组4只免疫小鼠均产生了能与汉滩病毒抗原发生反应的特异抗体。该研究为进一步研制以腺病毒为活载体的汉坦病毒工程疫苗奠定了基础。
将IBDV上海超强毒株的多聚蛋白基因（vp2-4-3）克隆入真核表达载体pALTER-MAX，构建成功pALTER-MAX-VP2-4-3真核表达质粒，经纯化后，pALTER-MAX-VP2-4-3在LipofectamieTM 2000介导下转染Vero细胞、11日龄鸡胚的绒毛尿囊膜（CAM）和肌肉注射2日龄的雏鸡，1周后，分别提取细胞或组织中的总DNA或总RNA，用DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号；转染的Vero细胞飞片和肌肉冰冻切片，进行免疫荧光检测均呈现阳性结果；转染的鸡胚CAM匀浆上清，用兔抗IBDV超强毒的高免血清，经Dot-ELISA检测呈现阳性。表明转染后基因获得表达，表达的蛋白具有免疫反应性。
获得稳定、高效的具有良好抗原性的蓝舌病毒(Bluetongue virus，BTV) vp7基因重组抗原。将BTV编码群特异性抗原VP7的S7基因片段克隆至pMD18-T质粒载体中，构建S7克隆重组质粒，进行核苷酸序列分析。与已报道的多株BTV编码VP7的基因比较后发现，所测定毒株的核苷酸序列与BTV10型的S7基因同源性高达98.7%，推测的氨基酸同源性为99.3%，证实为BTV的S7基因。然后亚克隆插入pBAD / Thio TOPO表达载体，转化LGM194细胞，经抗性培养、PCR、限制性内切酶分析、测序鉴定，筛选获得BTV S7基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆，成功构建了BTV群特异性抗原VP7的重组表达载体。经L-araboinose诱导表达，可稳定、高效地表达VP7蛋白抗原。SDS-PAGE、ELISA试验表明，表达蛋白为融合蛋白，具有反应原性，分子量约54.5kD，重组蛋白的获得率为1.52mg/g湿菌，其表达产量约占菌体总蛋白的12%左右，相当于93.5mg/L菌液。融合蛋白中含有BTV VP7 特异性蛋白抗原，可作为c-ELISA包被抗原，为蓝舌病的免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基
以Vero细胞为基质制备马抗狂犬病血清用抗原，以期建立有效、经济、简便的抗原制备方法。用含10%马血清营养液对Vero细胞作适应性培养，接种狂犬病毒，以含1%~3%马血清营养液作维持液培养病毒，于第5，8天收获病毒液，经灭活、浓缩、离心等制成抗原。第5，8天收获病毒滴度可稳定在7.0logLD50/ mL以上，灭活抗原具良好的抗原性，用NIH法测定效价达6.0IU/ mL以上，可用作抗原生产抗狂犬病血清。
对4个IBDV野毒株的致病性和它们的vp2基因高变区序列同时做了比较分析。结果表明， 4个IBDV毒株在致病性程度上存在较大差异。其中有一个是真正的超强毒，即GX8/99，其他几个虽然达不到真正超强毒的毒力，但也比经典的标准毒的致死性高得多。在vp2基因高变区，这4个IBDV野毒株与超强毒参考株HK46同源性很高，在DNA水平为96.8%～99.5%,在氨基酸（aa）水平为96.6%～100%。而与疫苗毒D78有很大差异，分别只有91.7%～93.6%和91.8%～93.2%。说明IBDV毒株的vp2基因高变区确实与其致病性有一定关系。特别是SD-1/97、SD-3/98、JS-30/99株之间及其与HK46在DNA和aa水平的同源性高达98.4%和98.6%以上，SD-3/99、JS-30/99株之间及其与HK46的氨基酸同源性为100%。然而,致病性特别高的GX8/99株病毒与其他3个野毒株及HK46在DNA和氨基酸水平的同源性相对较低,在DNA和aa水平的同源性只有96.8%～97.2%和96.6%～97.9%。相对于国内的流行毒株和香港超强毒参考株HK46, GX8/99株在致病性和VP2高变区都已发生了一定的变异。
将已构建成功的重组质粒pETN转化入E.coli BL21(DE3)中，在最佳诱导条件下获得重组N蛋白。随后用His-Bind对表达产物进行纯化，对纯化效果及纯化产物的特异性分别用SDS-PAGE电泳及Western-blot试验检测。在此基础上，以纯化的重组N蛋白作为包被抗原，对各种条件进行优化（如抗原的包被，作用时间及底物的选择），确定了判定标准，建立了检测PRRS抗体的间接ELISA方法。用此方法检测了200份血清样品，并与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果相比较，符合率达91%。
通过PCR方法，将禽网状内皮组织增殖病病毒（REV）的长末端重复序列（LTR）扩增并克隆进pUC-18质粒多克隆位点（MCS）的EcoR I和Sac I之间，并以BGH基因的多聚腺苷酸序列作为终止子克隆到Sph I和Hind Ⅲ之间，构建成重组质粒pUC-LTR。将GFP基因和REV囊膜糖蛋白gp90基因分别克隆到pUC-LTR载体中，获得质粒pUC-LTR-GFP和质粒pUC-LTR-gp90。重组质粒经转染48h，能够检测到外源基因的表达。本研究提示，REV LTR能够作为启动子构建表达质粒。
为了分析马立克氏病病毒（MDV）致病型与其DNA聚合酶基因的关系，本研究比较了9个不同致病型的该基因的同源性关系，这包括四种不同致病型的国际参考株即弱毒疫苗株CVI988/Ripens株、强毒株GA、超强毒株Md5和特超强毒株648A；中国疫苗株814、中国强毒参考株Jing-1及3个中国野毒株。结果表明：MDV的DNA聚合酶基因非常保守，在比较的9个毒株间，该基因上游约369个碱基的调控序列的同源性在96.7%~100%之间，该基因编码的1220个氨基酸序列的同源性在99.2%~100%之间。尽管不同毒株在一些位点上出现了氨基酸的变异，但这些变异与病毒的致病型或地域分布没有明显的关系。
提取6株O型口蹄疫病毒（FMDV）（T1-T6）的RNA，用一对通用引物经RT-PCR方法将6株FMDV VP1基因片段扩增出来。克隆测序,核苷酸序列分析表明，T1-T6六株vp1基因的核苷酸序列同源性在95%～99.8%之间，氨基酸序列同源性在94.8%～100％之间。T1-T6六株病毒vp1基因的核苷酸序列与已经发表的O/HKN/14/82、O/TAW/81/97、O/PHI/7/96、O/HKN/1/99和O/HKN/16/96的同源性较高，核苷酸序列同源性在86.1%～95.8％之间；发现6株毒株的主要中和抗原表位140-160、200-213位的氨基酸序列完全相同，推测它们有相近的中和抗体表位和抗原性。故推断本试验中的6株FMDV株属于同一基因型，即FMDV O型中国拓朴型(Cathay topotype)。
根据反义RNA作用原理，设计一条互补猪传染性胃肠炎病毒基因（26888-27184）区的反义RNA序列。将该序列与逆转录病毒表达载体构建成质粒PLXSN-N5’，并与质脂体共转染PA317细胞，经G418（500 μg/ml）筛选出稳定的产毒细胞克隆。取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3，测定细胞克隆产生的假病毒滴度，用高滴度假病毒感染IBRS2细胞。提取被感染的IBRS2细胞总DNA和RNA，通过PCR和RT-PCR证明PLXSN-N5’整合到IBRS2细胞基因组。病毒感染细胞病变表明，反义RNA有明显抑制TGEV复制的作用。
Mx蛋白是一类由I型干扰素诱导表达的抗病毒蛋白。本研究以感染了鳜传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV）的鳜鱼为材料，提取肝脏总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出Mx蛋白基因的核心片段序列，再应用3’和5’快速扩增cDNA末端（RACE）方法PCR扩增Mx蛋白cDNA末端，最终获得鳜鱼Mx蛋白cDNA序列（GenBank登陆号：AY392097）。序列分析表明：鳜鱼Mx蛋白cDNA含有2391bp，其中编码区长1881bp，编码627个氨基酸残基，推测蛋白质分子量大小为7.15kDa。鳜鱼Mx蛋白具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征：一个三联体GTP结合区域（GXXXSGKS/T、DXXG、T/NKXD）；一个发动蛋白家族的典型结构特征序列（LPRGS/KGIVTR）；以及C端高度保守的Leu拉链结构域。鳜鱼Mx蛋白全基因的获得为下一步研究鱼类Mx蛋白的抗病毒活性、作用机制，以及干扰素的检测奠定了基础。
类蜗牛毒素基因（conotoxinlike, ctl）是在一些杆状病毒基因组中存在的与蜗牛毒素类似的一类基因，其功能尚不清楚。本文利用苜蓿银纹夜蛾核多角病毒（AcMNPV）bacmid表达系统构建了含油桐尺蠖核多角体病毒（BusuNPV）ctl基因的重组病毒AcBac-ph-ctl。在细胞水平上对ctl基因的RT-PCR分析表明，该基因转录出mRNA。在甜菜夜蛾体内进行了生物活性测定，结果表明AcBac-ph-ctl与对照野生型AcMNPV的LC50，ST50无显著性差异，表明在此系统中，外源的CTL无杀虫增效性能。
采用RT-PCR方法自紫藤脉花叶病毒北京分离物（WVMV-BJ）的基因组中分离出其CP基因，连接到原核表达载体pET22b(+)上。获得的重组子pET-WVMVCP转化大肠杆菌BL21（DE3）后，用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明，cp基因在大肠杆菌中获得了高效表达，融合蛋白分子量约为34.4 kDa。将融合蛋白纯化后免疫兔子，获得了特异性较高的抗血清。微量免疫沉淀法测定该抗血清的效价为1/1024，酶联法 (enzyme-linked immunosorbant assay，ELISA)测定的效价为1/8192。
The purpose of the present study was to determine the prevalence of swine Hepatitis E virus (HEV) infection in Xinjiang. 813 swine serum samples collected from 1 to 12 months of age at 9 swine farms in Xinjiang region were tested by ELISA for the presence of IgG antibodies against HEV. The recombinant protein pUS166 containing region 452-617aa of the ORF2 of HEV US strain was used as coating antigen. The result showed that anti –HEV IgG were detected in 265 of 405 pigs (65.43%) in one group and 238 of 408 pigs (58.33%) in another group , and that the seropositivity rate was not related to geographic district and breeds, but differed remarkably by age, being 40% among the 1- to 3-month-old piglets, but 77.33% among ones over 3-month-old. It suggested that swine HEV was widespread in different geographic regions of XinJiang.
39卷第1期 (2024年2月)
ISSN 1674-0769
EISSN 1995-820X
CN 42-1760/Q
主编: 石正丽
影响因子: 5.5*
*源于2022年JCR
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