2004年19卷4期
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通过基因芯片技术观察汉坦病毒感染细胞后整合素受体信号转导相关基因的差异表达，以探讨汉坦病毒进入细胞的分子机制。用汉滩病毒76-118株感染原代人胚肺成纤维细胞，同时设立正常对照细胞，于感染后第6h、24h和96h同时抽提感染组与正常对照组细胞总RNA，利用荧光标记dUTP逆转录制备cDNA探针，与人类受体及信号转导类表达谱芯片杂交，并对Cy3、Cy5荧光信号做扫描分析。结果显示有37项基因出现差异表达，其中31项基因在感染后6h出现差异表达，13项下调、18项上调；但在感染后24h和96h分别只有5项和4项基因出现表达差异；而且整合素信号转导通路中的重要基因如一些蛋白激酶相关基因在感染6h表达增强，丝化增强子1在感染6h和96h表达下调，微管相关蛋白1A在感染6h表达上调、感染24h和96h表达下调。这些进一步说明汉坦病毒感染细胞与整合素有关。
采用一种含有HCV全基因组和噬菌体T7启动子和终止子序列的载体（pHCV）转染Vero-E6细胞，随后感染高效表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒（vTF7-3），通过vTF7-3的辅助作用，使Vero-E6细胞高效增殖HCV病毒体，建立了一种新的HCV体外细胞培养体系。RT-PCR、荧光定量PCR检测转染细胞裂解液中HCV滴度的结果显示：pHCV转染细胞内HCV基因拷贝达107-108/mL，同时有HCV正链RNA合成；免疫印迹显示该培养体系中有HCV结构蛋白、非结构蛋白的表达；pHCV转染细胞经透射电镜观察，可见清晰的HCV病毒体，直径在40-50nm。这一新体系的初步建立，为研究HCV的复制机制、制备HCV疫苗和研发抗病毒药物奠定了基础。
为深入探讨HCV-NS3蛋白的酶动力学性质，制备了具有蛋白酶及解旋酶活性的HCV NS3重组蛋白。利用PCR扩增HCV非结构基因NS3，插入pPIC9，测序分析。携带NS3基因的重组质粒(pPIC9-NS3)转化毕氏酵母菌菌株GS115，甲醇诱导表达NS3蛋白。重组蛋白首先采用Hitrap chelating柱进行亲和分离，之后使用Mono S HR柱进一步纯化。对纯化后的NS3重组蛋白的酶活性进行分析，结果表明，获得的重组蛋白分别具有蛋白酶及解旋酶活性。本研究为深入探讨NS3编码酶的功能和开发抗病毒药物创造条件。
前基因组mRNA是HBV(Hepatitis B virus)基因表达和复制的重要中间产物，全长的前基因组mRNA分子具有复杂易变的二级结构，是设计抑制HBV的核酶时所必须考虑的因素。我们使用多个最新的计算机软件对HBV前基因组mRNA二级结构进行模拟、分析，在全面分析核酶的可作用位点的基础上设计三个针对不同基因靶位的锤头状核酶，并对它们在细胞中对HBV的抑制作用进行研究。结果表明在HBV前基因组mRNA上存在几个高度复杂二级结构的区域，可能对核酶完全不敏感，而S、C、X基因的编码区是合适的核酶作用位点，都可达到对HBV的有效抑制，而且X基因位点的核酶对HBV的各种mRNA的抑制作用最为明显，是设计针对HBV核酶时应该优先考虑的位点。
将丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS2基因的全长序列插入到真核表达载体pCDNA3.1(-) CMV启动子下游，构建成重组质粒pCNS2。用脂质体LipoVecTM转染Huh-7细胞，转染细胞内可检出NS2的mRNA和蛋白质，表明构建的pCNS2可在Huh-7细胞内成功表达；把不同剂量的pCNS2质粒DNA与报告质粒pNF-κB-Luc共转染Huh-7细胞，48h后检测荧光素酶活性，结果显示与pCNS2共转染的细胞中pNF-κB-Luc表达出的荧光素酶的活性比对照细胞降低了约2~4倍，并呈明显的剂量相关性。表明HCV NS2对NF-κB激活转录活性有明显的抑制作用。这可能与HCV慢性持续性感染的致病性有一定的相关性。
应用PCR技术从含有HCV (Hepatitis C virus)全长开放阅读框的质粒pBRTM/HCV 1-3011中获得NS5A全长基因片断，利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中。通过酶切、PCR及测序鉴定NS5A基因已正确插入到pcDNA3.1(-)中，再利用脂质体介导转染Hela细胞，48h后传代并利用pcDNA3.1(-)质粒上的neo抗性基因加入G-418进行筛选。大约两周后，获得稳定表达的细胞株。经RT-PCR及western blot验证，证实HCV的NS5A基因在Hela细胞中已经获得了表达。在培养条件完全一致的条件下，表达NS5A基因的Hela细胞与pcDNA3.1(-)转染的细胞相比，生长速度明显变慢，其倍增时间约为35-36h，比对照组细胞增加了约50%，而转染pcDNA3.1(-)的细胞的倍增时间与正常Hela细胞则无明显差别，都为23-24h。从而证明HCV的NS5A蛋白具有抑制Hela细胞生长的作用。
运用RT-PCR技术从原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）患者的癌旁组织中扩增了Hepsin基因编码区序列，该序列已被克隆并构建了pCMV-tag-HS表达质粒。将pCMV-tag-HS表达质粒和表达HBx蛋白的载体共转染HepG2.2.1.5细胞，观察HBx蛋白和Hepsin蛋白相互作用对HBV病毒复制和病毒蛋白表达的影响。研究结果表明共表达HBx蛋白、Hepsin蛋白可以协同提高HBV病毒颗粒在培养液中的拷贝数，并提高HBV病毒蛋白HBs、HBe的表达水平。这说明HBx蛋白和Hepsin蛋白相互作用可以增强HBV病毒的复制。
用BTV-HbC3感染人肺癌SPC-A-1细胞，人宫颈癌HeLa细胞，人星型胶质瘤U251细胞，小鼠星形胶质瘤C6细胞及人胚肺HEL细胞后，观察细胞病变效应(CPE)；运用透射电镜技术及琼脂双扩散试验检测BTV-HbC3对各种不同肿瘤细胞及人胚肺HEL细胞的感染性；并用RT-PCR技术检测蓝舌病毒的增殖情况。结果显示，BTV-HbC3对正常HEL不感染，但能在不同来源的某些肿瘤细胞中选择性增殖，产生不同程度的细胞病变效应（CPE）及调亡现象，终致肿瘤细胞死亡。其中以人肺癌SPC-A-1细胞对其最为敏感。 因此，初步认为BTV-HbC3株能靶向性杀死某些肿瘤细胞，从而为深入开展BTV-HbC3靶向性抗肿瘤的研究提供了第一手实验室依据。
对猪细小病毒(PPV)SD-68株NS1基因进行了克隆和序列测定，结果表明SD-68株NS1基因全长1989bp，编码662个氨基酸组成的多肽。该序列与PPV SY-99株、Kresse株、NADL-2(5075)和NADL-2(4973)株的NS1基因比较，核苷酸的同源性分别为99.9%、99.9%、99.7%、98.1%，氨基酸的同源性分别为99.7%、99.5%、99.5%、96.7%。PPV SD-68株与MVM(i)、MEV(Abashiri)、CPV、FPV、BPV3、GPV NS1的进化树分析表明：PPV SD-68株NS1与MVM(i) NS1亲缘关系最近，与BPV3 NS1的亲缘关系最远；在Thr435和Ser473位点PPV SD-68株与MVM(i)完全一致，表明Thr435和Ser473是PPV SD-68株NS1潜在的磷酸化位点。
经刀豆素（conA）刺激诱导奶牛外周血淋巴细胞，应用RT-PCR方法从其总RNA中对奶牛γ干扰素基因cDNA进行扩增，然后将特异性片段连接到pMD18-T载体，测序结果表明，与已知序列同源性为100%。然后将特异性片段连在pRLC载体上进行表达，经SDS-PAGE分析，原核表达产物为16kDa的重组蛋白，占菌体总蛋白的42%，表达产物以包涵体形式存在。经7mol/L盐酸胍的变性液溶解及0.5mol/L盐酸胍复性液处理，表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化，细胞病变抑制法结果表明，重组牛IFN-γ具有较高的干扰素活性，约为6.0×105U/mg。
从戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）IgG检测阳性的新疆某猪场采集70份猪粪便，利用逆转录套式聚合酶链方法（RT-nPCR），检测HEV RNA，其中13份为阳性，阳性率18.57%。将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上，构建成重组质粒并测序，结果表明，13株猪源HEV分离株在HEV ORF2 348bp核苷酸序列的同源性为97.1%～100%，为同一基因型；与HEVⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的同源性分别为74.1%～77.6%，71.6%～74.1%，73.3%～78.2%和82.8%～91.4%，与ⅣA亚型的同源性同源性最高达89.4%～91.4%。以该核苷酸片段绘制的基因进化树显示13株猪源HEV与HEV Ⅳ T1株在同一分支上，属基因Ⅳ型；与国内其他猪源HEV分离株该片段核苷酸序列的同源性为82.6%～91.3%，提示中国猪源HEV的基因型比较一致，同属HEV Ⅳ型。
本研究通过PCR技术克隆了猪β干扰素全基因，设计引物亚克隆猪β干扰素成熟蛋白编码基因并对, 5’端1个稀有密码子进行了大肠杆菌偏嗜性改造。构建了猪IFN-β原核单纯表达载体pRLC-poIFNβ，实现了poIFN-β在大肠杆菌中的表达, 表达产物约占菌体总蛋白的17.3%。表达产物以包涵体形式存在，用含6mol/L 盐酸胍的变性液溶解及含GSH-GSSG复性液复性处理，复性后的表达产物经凝胶层析纯化后，MDBK细胞-VSV病变抑制法测定结果表明，重组猪β干扰素具有良好的抗病毒活性，约为5.6x105U/mg。用重组猪β干扰素处理猪肾传代细胞PK-15后，细胞病变抑制法(CPE50)测定结果表明：重组猪β干扰素可显著抑制猪流行性腹泻病毒（PEDV）的感染。
通过PCR方法扩增MDV Md11株pp24基因的完整ORF，按正确的阅读框架将其克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中，重组质粒转化BL21宿主菌后，经IPTG诱导表达。诱导菌体裂解物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，用山羊抗GST抗体进行Western-blotting试验，结果确证了GST-pp24融合蛋白的表达。将表达产物从凝胶中回收，免疫4周龄小白鼠，3次免疫后，采血分离血清。所得抗GST-pp24多克隆抗血清分别与GA株、Md11株和CVI988株MDV感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）进行间接免疫荧光试验（IFA），结果表明大肠杆菌表达的pp24融合蛋白至少保留了部分天然pp24蛋白的抗原性。
本文研究在生物反应器中用微载体连续灌注培养Vero细胞生产狂犬病毒制备技术。在5L体积的生物反应器中，加入含10g/L微载体的199培养基，接种Vero细胞至细胞浓度达到1×105/mL，培养7d后细胞可生长至6~7×106/mL，然后以感染复数（MOI）为0.01接种狂犬病毒VaG株，接毒后24h开始收获，连续收获12d左右，收获的病毒滴度范围在6.0~8.5log LD50/mL，收获的病毒原液经浓缩、灭活和纯化等步骤制备成疫苗，各项质量指标均达到《中国生物制品规程》2000年版要求。实验表明，用生物反应器微载体灌注培养制备人用Vero细胞狂犬病疫苗小试工艺可行。
为减少重组病毒非必需外源基因，进一步提高非复制重组痘苗病毒狂犬病疫苗的安全性，本研究改建不含报道基因LacZ的双表达狂犬病毒aG株G、N的非复制重组痘苗病毒VTKRGΔCKRN。采用G418-neo富集、蓝白斑及免疫蚀斑筛选等方法，以表达狂犬病毒糖蛋白(RG)基因 的非复制重组痘苗病毒VTKRG△CKlacZ作为亲本株，利用同源重组原理，删除C与K片断间lacZ，并将狂犬病毒核蛋白（RN）基因插入C-K片段间。 经核酸及蛋白水平检测表明VTKRGΔCKRN能同时稳定有效地表达狂犬病毒G和N，并具有非复制病毒生长特性。重组病毒裸鼠毒力实验表明VTKRG△CKRN较复制型重组痘苗病毒VTKRG病毒毒力显著减弱。VTKRGΔCKRN免疫小鼠可诱生较高有效中和抗体,并能保护小鼠免于致死剂量狂犬病毒攻击。以1.6×106PFU较低免疫剂量、仅一次免疫狗可保护狗经致死量中国狂犬病毒街毒株SBD株攻击后存活，诱生具有保护性中和抗体。非复制狂犬-痘苗重组病毒VTKRGΔCKRN免疫效果好、更具安全性。
根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus, HaSNPV) fp25k基因的序列，设计引物，引入适当的酶切位点，利用PCR扩增出基因片段。将该基因片段克隆至原核表达载体pProEXHTb，经IPTG诱导，在大肠杆菌DH5中获得了高效表达，表达产物的大小为32kDa。纯化蛋白产物免疫家兔制备抗血清。该抗血清可与原核表达的GST-FP25K融合蛋白及在感染的昆虫细胞中表达的FP25K蛋白发生特异性免疫反应。该抗体的获得为深入研究FP25K蛋白的功能提供了基础。
了解植物病毒在不同水体与温度条件下的灭活规律具有重要的理论与实际意义。本文以典型植物病毒烟草花叶病毒（TMV）为模型，比较了其在不同温度条件下，在闽江水、自来水、生活污水、微孔滤膜过滤除菌污水及超纯水中的灭活动力学。结果显示，温度是导致TMV灭活的重要因素，水温升高，病毒灭活速率加快；此外，某些水质因子也影响TMV的灭活效率，其中可溶性盐的存在及其含量对TMV的灭活会因所处的环境不同而异；某些微生物或代谢产物对植物病毒TMV具有灭活作用，而能生化降解的有机质加速TMV灭活可能是通过促进水体中的微生物增殖而起作用。
本试验利用指示菌MC1061，经双层琼脂法纯化和PCR扩增vt2基因，分别从大肠杆菌O157菌株、牛粪、鸡粪和污水中分离获得5株含vt2基因的噬菌体。这些噬菌斑透明，直径为0.5-2 mm，对指示菌的感染效价均在109 PFU/mL以上，抵抗氯仿和56℃30min的作用。将噬菌体分离株SHφW1感染MC1061后，经PCR鉴定获得一株溶源菌株(MC1061/SHφW1)。溶源株的LB培养滤液对Vero细胞产生了显著的病变效应，而MC1061在同等条件下培养的滤液无细胞病变，表明VT2噬菌体通过溶源将vt2毒力基因水平转移，证实了VT2噬菌体的转染与细菌毒力相关。
通过一对自行设计的引物，以E. coli染色体DNA为模板进行PCR扩增，获得完整的recA基因。将PCR产物和pUC18在体外进行连接后，并分别转入E. coli DH5α和E. coli k12(λ+)，筛选出含重组质粒(pUR4) 的转化子。在诱导条件和非诱导条件下，分别测定recA基因在不同转化子中的生物学功能。结果表明recA基因在溶原菌中表现出明显的生理功能，能使λ原噬菌体从溶原状态进入裂解循环。这种重组质粒将在进一步研究λ原噬菌体的诱导机理以及受紫外辐射损伤细胞的修复作用等方面成为有效的工具。
Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) isolates identified in samples from 50 field cases originated from eastern China herds were studied. ORF5 gene of PRRSV isolates was amplified by reverse transcript polymerase chain reaction(RT-PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) patterns for enzymes MluⅠ, HincⅡand SacⅡwere determined on these ORF5 genes. The RFLP pattern obtained from 39 isolates was 2-2-1(78%), 3 isolates was 1-1-1(6%) and 8 isolates identified in 2003 was 1-3-1 (16%). The results showed PRRSV strains have variations and existed no less than 3 gene subtypes in the area.
The purified recombinant nuclocapsid protein of PRRSV was used to conjoined with latex, and the conjoined concentration，temperature and time were optimized, a detection method for serum antibodies against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus was established. Some tests for the method’s sensitivity, specificity and stability were confirmed. About 200 serum samples were detected by using the method, and these samples were also detected by recombinant N protein based ELISA and IDEXX ELISA kit. The result showed that the agreement ratio of the recombinant N protein based LAT with other two methods arrived at 93%, 78%, respectively.
Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), direct florescent antibody staining, and RT-PCT were used to detect growth characteristics of Cassical swine fever virus C-strain (Derived from Spleen) in SK6 cell. The results indicated than C-strain (Derived from Spleen) can grow in SK6 cell at a lower level. Direct florescent antibody staining method was not suitable for the detection of attenuated lapinized C-strain. The study provided a primary guide for the detection of attenuated classical swine fever virus. It also supplies an elementary foundation for the study of its growth characteristic in SK6.
A novel procedure was used for cloning large adenovirus genome fragment by the homologous recombination in E.coli strain BJ5183. The 11.2Kb downstream fragment of the CAV-2 strain YCA18 genome was cloned by homologous recombination, the 1029bp left end and the 970bp right end of this fragment were separately amplified by PCR. They were then cloned into plasmid pPoly2 with direction from left fragment to right fragment, obtaining a“rescue”plasmid pT615. The pT615 was liberalized by Hind Ⅲ and PstI digestion and was cotransformed with the purified CAV-2 genome which was cut by BstBI into competent E.coli strain BJ5183. Recombinant plasmids harboring the 11.2Kb downstream fragment of CAV-2 genome were obtained after bacterial intermolecular homologous recombination. The recombinant efficiency of all E.coli strains tested was 78.3%. One of the recombinant plasmids, pT618, was further identified by enzyme digestion analysis and PCR amplification. The results showed the plasmids contained the 11.2kb fragment downstream the genome of CAV-2.
In order to study the feasibility of gene chips technology in the detection of HBV mutation associated with lamivudine, we detected the mutation of HBV in peripheral blood of 30 patients treated with lamivudine for at least half a year by gene chips. The result was compared with that from direct sequencing. Both results are highly coincident. The rate reaches 100% while detecting single strain of virus infection, and 85% in multi-strains virus infection. Gene chip technology is quite valuable and practical in future clinic.
39卷第1期 (2024年2月)
ISSN 1674-0769
EISSN 1995-820X
CN 42-1760/Q
主编: 石正丽
影响因子: 5.5*
*源于2022年JCR
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