2004年19卷6期
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本研究分析了人乳头瘤病毒-6型L1外壳蛋白之B-细胞优势表位，并拟以此为基础制作表位多肽疫苗。研究中采用Goldkey和PC/Gene软件系统综合分析HPV6之L1蛋白B-细胞优势表位后，Fmoc固相合成表位多肽，通过HPLC纯化和毛细管电泳分析其纯度。与佐剂完全乳化后，免疫小鼠，进行动物水平的免疫效果评价。取免疫小鼠血清，与HPV-6 DNA阳性的尖锐湿疣患者疣体组织上清液结合，以鉴定免疫小鼠所产生抗体的特异性。发现L1蛋白第425-439位和第486-500位具有较高的免疫原性，可明显诱导小鼠血清抗体滴度升高，且该抗体与人尖锐湿疣疣体组织上清液呈阳性反应。说明所选这两个肽段为HPV6之L1蛋白的B-细胞优势表位，但诱导产生的抗体是否具有功能特异性，正在做进一步研究。
为建立恒河猴严重急性呼吸道综合征（SARS）的模型并对其致病特点进行观察，采用病毒分离、免疫荧光、光镜及RT-PCR方法对病毒感染组和非感染组恒河猴不同时间、不同组织或分泌物进行检测。结果显示从恒河猴不同组织中分离到病毒，而且在病毒感染后第2d和第5d的血液、第7、9d的鼻咽分泌物、第3d的粪、第5d的粪尿中均检测到SARS-CoV RNA。光镜观察到病毒感染组肺组织肺泡间隔增宽，有大量淋巴细胞、单核细胞浸润，肺泡腔有渗出，甚至形成透明膜样物；多个肺泡形成机化性肺炎的表现。感染组肝组织可见较大的坏死灶，并伴有大量炎性细胞浸润。结论认为已成功建立了恒河猴SARS模型，可用于评价抗SARS药物和疫苗的研究。
为了解慢性乙型肝炎病毒感染与原发性肝癌的关系，本文采用回顾性研究方法对328例原发性肝癌病人与同期收治的340例非肝癌的其他消化道肿瘤病人的乙型肝炎病毒感染血清标志物（HBV M）及肝功能检测结果进行对比分析。结果显示肝癌组乙肝表面抗原（HBsAg）阳性率（63.11%）显著高于非肝癌组（消化道其他肿瘤对照组）（11.47%）。肝癌组慢性乙型肝炎病毒感染“HBsAg、抗-HBe和抗-HBc三者均表达为阳性者”（37.2%）显著高于“HBsAg、HBeAg和抗-HBc三者均表达为阳性者”（6.4%）。肝功能检测结果，“HBsAg、HBeAg和抗-HBc三者均表达为阳性组”与“HBsAg、HBeAg和抗-HBc三者均表达为阳性组”比较无显著性差异（P0.05），而肝癌组与非肝癌组比较，肝癌组肝损害显著高于非肝癌组（P0.01）。表明慢性乙型肝炎病毒感染在原发性肝癌病因学中起着十分重要的作用，“HBsAg、抗-HBe和抗-HBc三者均表达为阳性者”是原发性肝癌的高危人群。
呼吸道合胞病毒 (RSV)感染遍布全球，并可导致严重的疾病，但目前尚无成功的疫苗问世。为寻求可能用于RSV疫苗研制的重组蛋白抗原，我们在克隆RSV-A全长G蛋白基因的基础上，构建了多种共表达载体蛋白和G蛋白片段的表达载体，并从中筛选出能以可溶形式高效表达抗原蛋白的原核表达体系。通过亲和层析纯化了重组蛋白抗原DsbA-G101，将其免疫Balb/c小鼠后获得了相应的抗血清。经ELISA检测表明DsbA-G101具有良好的免疫原性。基于本研究所构建的系列表达载体，可以比较不同的G蛋白片段免疫原性的强弱及载体蛋白的优劣，从中发现最佳的RSV抗原蛋白。
利用真核表达载体pVAX1构建HIV-2 gag-gp105嵌合基因的重组质粒pVAX1gag-gp105，将其转入BHK21细胞中，利用间接免疫荧光方法检测其表达情况。进一步分别将核酸疫苗质粒pVAX1gag-gp105、对照组质粒pVAX1和PBS溶液经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠脾CD4＋、CD8＋T细胞亚群的数量,脾特异性CTL 杀伤活性和血清抗体滴度。结果显示，重组核酸疫苗质粒pVAX1gag-gp105疫组小鼠脾CD4＋、CD8＋T细胞亚群的数值均比对照组高( P0.01)，脾特异性CTL 杀伤活性与对照组相比差异极显著(P0.01)，血清抗体滴度显著高于对照组(P0.01) 。以上结果表明，HIV-2 gag-gp105嵌合基因DNA疫苗对BALB/c小鼠具有良好的体液和细胞免疫原性。
利用DNA重组技术将丙型肝炎病毒（HCV）H77 株E1E2囊膜蛋白基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro 中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E1E2，该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞，经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术（FACS）分析，结果表明HCV e1e2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E1E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BA LB/c小鼠，经FACS分析免疫鼠血清，成功诱导小鼠产生了抗HCV E1E2蛋白的抗体，Western blot表明该抗体能与原核系统表达的E2蛋白结合。
对猪细小病毒（PPV）SD-68株vp2基因进行的克隆和序列测定表明：SD-68株VP2基因全长1740bp，编码579个氨基酸残基组成的多肽；PPV SD-68株与Kresse株、SY-99株、NADL-2（5075）株、NADL-2（4973）株、US-1株的VP2基因比较，核苷酸的同源性在99%以上，氨基酸的同源性在96%以上。进化树分析表明SD-68株与kresse株的亲缘关系最近；在决定毒株组织嗜性的关键氨基酸位点上(378，383及436)，SD-68株与kresse株的差异最小，据此推测SD-68株的组织嗜性与Kresse株相似，即SD-68株属皮炎型PPV； 而比较弱毒株NADL-2、SD-68和强毒株kresse VP2的氨基酸差异后发现，215、378和383可能是决定PPV致病性强弱的关键位点。
对虾白斑综合征病毒厦门分离株ORF220编码真核生物GP130受体同源蛋白。将ORF220和绿色荧光蛋白编码基因融合在一起克隆到昆虫杆状病毒表达载体pFastBacI，然后与AcBacmid共同转染DH10B细胞。用PCR鉴定含有ORF220和EGFP基因的重组质粒，提取纯化重组质粒并转染昆虫细胞进行表达。结果发现，DNA转染后3-5d可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光，表明融合蛋白在昆虫系统内成功表达。用病毒上清液感染昆虫细胞进行时相观察，结果表明，ORF220蛋白在昆虫细胞的细胞质和细胞核内呈随机分布，没有特异的细胞定位。
为分析JDV Tat在反式激活JDV及HIV-1 LTR过程中是否采用与HIV-1 Tat类似的细胞因子，本文构建了包含完整激活域的jTat70和hTat47，同时构建了cyclin T1和CDK9真核表达及反义转译质粒。过量表达hTat47和jTat70对hTat反式激活HIV-1 LTR，jTat反式激活JDV和HIV-1 LTR均有明显的抑制作用推测jTat和hTat的反式激活作用可能涉及类似的细胞因子。通过cyclin T1和CDK9的反义转译质粒对jTat反式激活的抑制作用证实这两种细胞因子参与了jTat对JDV和HIV-1 LTR的反式激活。
应用Pichia酵母表达系统高效分泌表达了传染性传染性法氏囊病病毒vp2基因片段。首先用Primer5.0设计1对引物P1、P2，以插入IBDV vp2 基因的PMD18-T-VP2载体为模板，扩增出带有终止密码子的1.4 kb片段，将此片段正向亚克隆到酵母表达载体pPICZα-A上，将构建好的重组载体pPICZα-A-VP2用SacⅠ内切酶线性化后，电击转化整合入Pichia PastorisX-33酵母菌，经高浓度ZeocinTM 筛选、表型鉴定、诱导表达及表达产物的鉴定，得到高效表达vp2基因的酵母工程菌X-33/ pPICZα-A-VP2。工程菌72h培养上清的SDS-PAGE电泳与免疫印迹结果显示，vp2基因表达产物大小约为55 kDa，比预期的41kDa大。凝胶薄层扫描结合Bradford 蛋白质总含量测定结果表明，表达产物占工程菌培养上清总蛋白的28%，表达量可达23 mg/ L。间接ELISA结果表明重组表达产物能够有效地区分法氏囊病病毒标准阳性与阴性血清。
根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因 vp19和vp28的序列，设计并合成两对引物，PCR扩增得到vp19和vp28两基因，大小分别为370bp和630bp。通过EcoRI位点连接两基因，再按正确的阅读框插入表达载体pET-22b（+）中，构建出重组表达载体pET-vp(19+28)并转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌株35℃IPTG诱导，表达产物经SDS-PAGE检测显示有与预期大小41kDa相吻合的融合蛋白带。用Ni2+-柱纯化的基因工程蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清，进行螯虾活体中和病毒实验，结果表明抗血清对WSSV的中和效率达到了100%。
猪瘟病毒（CSFV）囊膜表面结构糖蛋白E2 (gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。E2和Erns与细胞表面受体的相互作用介导病毒对细胞的感染过程。本文采用抗CSFV（Alfort Tübingen 毒株）E2结构蛋白的单克隆抗体c2410和a18，淘选噬菌体展示的12肽随机肽库，对CSFV E2蛋白表位进行分析。研究发现：单克隆抗体c2410和a18识别同一线性表位，定位于E2蛋白的832-837位氨基酸（SPTTLR），但二者在ELISA和免疫印迹分析中对不同表（拟）位的反应性存在差异。自杂交瘤细胞中提取总RNA，对单克隆抗体轻链和重链可变区cDNA进行序列分析。结果表明：c2410和a18虽然来源于同一批次融合的杂交瘤细胞系，识别同一表位，但仍属于不同的单克隆抗体。
基于猪瘟病毒主要保护性抗原E2囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位--B/C抗原区和A/D抗原区，设计一对特异性的引物扩增猪瘟病毒E2蛋白的A/D抗原区基因, 并将PCR产物克隆入含有强启动子PAOX1和α-MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαC中，构建成重组质粒pPICZα-AD，酶切线性化后电穿孔导入巴斯德毕赤酵母X33菌中，经ZeocinTM筛选得到5株高拷贝转化子，甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验表明酵母培养上清液中含有具有良好反应原性的E2蛋白，蛋白表达量达175.8μg/mL。N-糖基化分析显示该表达蛋白在分泌过程中发生糖基化。该研究为研制防治猪瘟的亚单位疫苗与诊断试剂盒奠定基础。
胸苷酸合酶（Thymidylate synthase, TS）是进行DNA合成所必需的酶类，与细胞分化及肿瘤发生密切相关。淋巴囊肿病毒属于虹彩病毒科成员，是能引起百余种淡、海水鱼感染，并产生肿瘤的病毒病原。在已完成中国淋巴囊肿病毒株 (Lymphocystis disease virus-China, LCDV-C) 基因组序列测定的基础上，本文对位于LCDV-C基因组开放阅读框 ORF 011L的TS基因结构、及其推定蛋白结构进行了分析。该基因全长858bp，GC含量为28.2%，编码一个长为286aa、分子量为32.7kD、等电点为7.1的推定蛋白，称之为中国淋巴囊肿病毒胸苷酸合酶(LCDV-C TS)。该酶所具有的叶酸结合区在第44和70位氨基酸之间，dUMP 结合区在第163和206位氨基酸之间，24个必需氨基酸具有高度保守性。二级结构预测结果显示 LCDV-C TS 含8个α螺旋，6个β折叠和23个环，表明其具备酶活性分子所有的柔性和可变性结构特征。这是迄今所知在脊椎动物虹彩病毒中唯一含两个完整结合区的TS。对来自包括LCDV在内二十个物种的TS结构进行同源性分析，显示LCDV-C TS被单独分为一枝。进一步对LCDV-C TS可能的起源途径及与宿主的作用等进行了探讨。
在构建了伪狂犬病病毒上海株的缺失载体pgEI-GFP基础上，将pgEI-GFP转染感染了PRV-SH株的BHK-21细胞，待出现80%以上的细胞病变时收获病毒，并以绿色荧光蛋白为标志，通过蚀斑法得到纯化重组病毒gE-/gI-/GFP+ 缺失株。研究了该缺失株的的安全性、在细胞上的生长特性以及对断奶仔猪的安全性、免疫原性等生物学特性。试验结果显示，缺失了gE-和gI-后，不影响其在RK细胞上的生长状况和病毒的滴度。该疫苗株对小鼠的半数致死量比亲本毒低且对家兔的致死性的时间延长了，这表明该疫苗的毒力比亲本毒有所下降。该缺失株对断奶仔猪安全，无不良接种反应，接种断奶仔猪能抵御高剂量PRV-SH株强毒的感染，攻毒后试验猪的发热期、散毒天数均低于对照组。该缺失株接种仔猪后在试验期间一直维持较高水平的中和抗体。
根据已发表的伪狂犬病病毒（PrV）gE、gI基因的序列，设计并合成了一对引物，以PrV容A株细胞培养毒为模板，筛选最佳反应条件和试剂工作浓度，建立了区分PrV野毒株和疫苗弱毒的鉴别PCR方法。该方法能从PrV容A株（RA）、上海株（SH）、鲁A株（LA）中扩增出一条848bp的片段，但Bartha–K61株没有扩增出该片段。测序结果表明PCR扩增产物和方法的特异性。对正常细胞与其它6种引起猪病毒性疫病相关病毒进行检测，结果均为阴性，没有出现交叉反应。对PrV容A株细胞毒提取物DNA进行检测,其最低检出量为5pg。PCR对感染野毒的发病猪不同组织器官检测发现，淋巴结检出率最高，依次为脾、脑（海马角）、肺、肾、肝等。对2003~2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的37个大中型猪场送检的172份病料进行PCR检测病料阳性率为20.34%（35/172），猪场阳性率为40.54%（15/37）。实验结果表明所建立的PCR技术可用于伪狂犬病野毒感染的快速鉴定和流行病学调查。
应用Pichia pastoris 酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV) S蛋白主要抗原区基因片断。用特异性引物扩增出CCV DXMV株S1基因片断，并将其克隆到pGEM-T载体中得到pTS1。用Kpn I和NotI双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZαA中，构建出重组质粒pPICZαAS1。将pPICZαAS1用Sac I内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞，用PCR法筛选阳性重组子。用1%的甲醇诱导重组酵母菌，取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果重组酵母菌培养物上清用SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白, Western-blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应。凝胶薄层扫描分析表明，3株重组酵母菌在1%甲醇诱导144h后，重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6.6-8.6%左右。用重组蛋白S1免疫BALB/C小鼠3次后，小鼠血清CCV中和抗体可达1:8-1:16，表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性。
本实验采用来源于江苏地区的六株不同鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）毒株，应用RT-PCR法对vp2基因高变区进行了扩增，构建重组质粒pMD18T- vp2，测序。与有代表性的 IBDV毒株VP2基因高变区序列进行比较分析，以ClustalX软件进行序列比对，得到基因序列及氨基酸序列同源性，IBDV Y3、P2G、P8G、SZ、Y5 和W04（6株）IBDV与D6984（荷兰）的同源性达到99.0%以上，与其它一些超强毒株（very virulent IBDV，vvIBDV）的同源性也达到了97.8%以上，并在关键氨基酸位点符合vvIBDV特征，采用Phylip3.5软件分析作出进化树，其结果从分子水平说明六个毒株均为vvIBDV，与欧洲和日本的超强毒株有较近的亲缘关系，而与美洲株的较远，从而为IBDV分子流行病学研究和疫苗的研制提供了科学依据。
用纯化的鸡抗禽流感病毒（AIV） IgG作免疫原，通过单克隆抗体技术制备出1株分泌针对鸡抗AIV和兔抗AIV共有独特型抗体的杂交瘤细胞。竞争抑制试验、特异性检验和诱导产生血凝抑制抗体的功能实验证明，此抗体具有AIV血凝素分子的内影象。
文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)S8片段被克隆和测序，该片段全长1332bp，编码390个氨基酸组成的分子量大约为43kDa的蛋白P44。根据本实验室测定出的马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV )基因组全序列,设计引物，扩增出文山松毛虫质型多角体病毒S8部分片段，并亚克隆出p44基因序列，然后将p44基因序列cDNA克隆到表达载体pET-28a中，构建成表达质粒pET-S8，用IPTG诱导大肠杆菌BL21，经SDS-PAGE证明p44基因在大肠杆菌中获得成功表达，并对其编码蛋白序列进行了分析。
本实验利用AcMNPV(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV)的bac-to-bac系统构建了两种重组病毒，即含GFP-actin融合基因的重组病毒AcMNPV-GFP-actin和含GFP基因的重组病毒AcMNPV-GFP。用这两种重组病毒分别感染Sf9细胞，以AcMNPV-GFP感染的Sf9细胞为对照，用共聚焦激光扫描显微镜观察了绿色荧光在病毒感染过程中的分布情况。由于肌动蛋白和绿色荧光蛋白是共定位的，所以绿色荧光的分布情况就是肌动蛋白的分布情况。实验中观察发现，AcMNPV-GFP感染的Sf9细胞中的绿色荧光，在整个感染过程中是弥散分布的，而AcMNPV-GFP-actin感染Sf9细胞后24-72h这段时间内，肌动蛋白最初聚集在细胞核内，随后逐渐由细胞核向细胞质转移，最后完全聚集于细胞膜。根据实验结果，推测肌动蛋白可能参与了AcMNPV出芽型病毒粒子（BV）由细胞核向细胞质运输以及从细胞膜排出的过程。
Using a pair of specific primers designed according to the relevant nucleotide sequences from GenBank, the main antigen domain for VP2 gene of Porcine parvovirus was ampilified with PCR method using the genomic DNA as template. The PCR product was cloned into the expression vector pIREShyg to get a recombinant eukaryotic expression plasmid pIREShyg-VP2, which was then transfected into the CHO-K1 cells. The expressed product was detected by IFA after the positive cell clone was selected with hygromycin. The result revealed that the main antigen domain for VP2 gene of porcine parvovirus was stably expressed in CHO-K1 cells.
In this essay the destructive rates of HBsAg, the surface antigen of HBV, exposed to different light sources and photocatalysed time on both TiO2 ceramic plate and Ni net were investigated, the effect of anti-HBV of TiO2 was discussed under different light condition.The result demonstrated that ceramic TiO2 plate has 87.50% destructive rate under high Hg lamp irradiation(8μW/cm2) after 4 hours, while the controlled normal ceramic almost had no influence to HBsAg. Also the result indicated that under indirect sunlight(20μW/cm2) for 4 hours, plate with TiO2 destroyed 93.75% of the HBsAg but the ordinary plate destroyed 87.50%.The Ni net with TiO2, when placed under ultraviolet irradiation (480μW/cm2)for 2,5,10 minutes destructive rates to HBsAg were 99.80%, 99.90%, and 100% respectively, but the controlled net without TiO2 thin film showed only 93.75% even after 10 minutes under the same ultraviolet.
39卷第1期 (2024年2月)
ISSN 1674-0769
EISSN 1995-820X
CN 42-1760/Q
主编: 石正丽
影响因子: 5.5*
*源于2022年JCR
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