2005年20卷4期
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本研究共收集95例罹患严重急性呼吸综合征(SARS)的医护人员的急性期和恢复期血清,用ELISA方法测定血清中白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素10(IL-10)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子β(TNF-β)以及转化生长因子β(TGF-β)水平,用流式细胞仪测定急性期患者外周血CD4+和CD8+T细胞比例。结果显示,SARS患者病程初、中期血清IFN-γ无明显改变;IL-2在起病2月内无显著变化,但在病程3~5个月时降低;IL-4在健康对照和患者均未能测出;TNF-β在SARS感染的1周内和病程第2个月内下降。与上述细胞因子形成对比,患者IL-10以及TGF-β均在发病起即持续升高直至整个病程。这些细胞因子的变化均与激素的使用无关(P0.05)。SARS患者急性期CD4+T细胞和CD8+T细胞急剧减少。可见,SARS相关冠状病毒感染可引起Th2细胞因子反应,可能损害患者的细胞免疫功能而促进体液免疫,IL-10和TGF-β可能在SARS的发病中起作用。
将猴免疫缺陷病毒(Simianimmunodeficiencyvirus,SIVmm239)中gag基因的衣壳蛋白部分置换成人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV-1HXBc2)的相应部分,构建出替换了衣壳蛋白基因的人/猿嵌合免疫缺陷病毒(SHIV)原病毒DNA。用此SHIV原病毒DNA转染293T细胞,细胞中能够检测到嵌合病毒基因的转录与翻译;在细胞培养液上清中亦可检测到装配出的病毒颗粒。病毒颗粒形态正常,含有基因组RNA,具有反转录酶活性,嵌合的外源衣壳蛋白能够正确剪切,形成棒状的核心。将此嵌合SHIV病毒感染MT4细胞,病毒能够吸附并进入细胞,能完成反转录过程,但不能增殖。
为探索以非复制型腺病毒为表达载体的多价轮状病毒(Rotavirus,RV)基因工程疫苗的可行性,在前期工作的基础上,对表达我国G2和G3型RV流行毒株vp7基因的重组腺病毒的免疫效果进行了研究。分别用表达G2和G3型vp7基因的重组腺病毒rvAdG2VP7、rvAdG3VP7经滴鼻和灌胃两种途径免疫Balb/c小鼠,对免疫后小鼠的血清抗体、黏膜抗体和相关的细胞因子水平进行了检测和比较。结果表明,用表达G2和G3型vp7基因的重组腺病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠后,均可诱导机体产生较强的RV特异性免疫反应,包括体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫,并能产生中和抗体。但免疫反应以Th2类为主,Th1类反应也占有相当的比例。本研究为新型RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基础。
在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,研究酵母表达的该乙脑病毒(Japaneseencephali-tisvirus)E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Hsp70)的融合蛋白以及该抗原肽与Hsp70上的一个功能域-肽连接区(Peptidebindingdomain,以下简称BD)融合形成的蛋白,用这三种蛋白分别免疫BALB/c小鼠,以酵母单独表达的E蛋白主要抗原片段免疫作为对照,比较它们对小鼠抗E蛋白主要抗原片段特异性的细胞免疫和体液免疫的影响。采用腹腔内注射蛋白的方法免疫小鼠,主要从IL-2的mRNA水平,淋巴细胞的增殖和抗体滴度这三个方面进行比较,最后我们得出E-BD融合蛋白在免疫效果方面比E-Hsp70略好一些,所以在本试验中肽连接区是完全可以代替Hsp70独立行使其佐剂功能。
从灵芝菌丝体中分离得到的多糖GLP具有抑制单纯疱疹病毒I型感染的作用,并对GLP抑制疱疹病毒复制的作用机制进行了初步探讨。GLP对Vero细胞的CC50值大于2000μg/mL,GLP在疱疹病毒感染细胞前、感染后和病毒感染细胞时加入到细胞悬液中的EC50分别为4.6、50和17μg/mL;而如果将GLP与细胞共同孵育后再用病毒去感染,其EC50为11μg/mL。同时,GLP抑制病毒感染的选择指数分别为435、40、118和182。如果在病毒感染细胞后加入GLP,在病毒的生物大分子的合成完成后而子代病毒粒子还未释放出来前去掉GLP,这时GLP对病毒感染就没有抑制作用。定量PCR试验进一步证明GLP发挥抑制疱疹病毒感染作用是通过阻断病毒感染细胞早期与细胞表明蛋白的吸附来实现的。
体外观察人中性粒细胞多肽1,3(Humanneutrophilpeptide,HNP1,3)及阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)对单纯疱疹病毒-Ⅰ型(Herpessimplexvirus1,HSV-1)的抑制作用。以Vero细胞为靶细胞,用各种浓度HNP1,3与游离病毒颗粒(直接失活组)及感染病毒后的靶细胞(复制抑制组)进行相互作用,镜下观察各药物对HSV-1致细胞病变效应的抑制作用,并采用ELISA法测定感染48h后药物对HSV-1囊膜糖蛋白分泌的抑制作用。MTT法检测各药物对细胞的毒性作用。结果显示直接失活组中,HNP1,3可使HSV-1的致细胞病变效应减轻,对HSV-1直接失活的50%有效浓度(EC50)为8.1μg/mL、10.03μg/mL;复制抑制组中,ACV使HSV-1的致细胞病变效应减轻,EC50为0.68μg/mL。MTT检测结果表明HNP1,3在治疗浓度范围内无明显细胞毒性。以上结果表明HNP1,3除具有较强的抗菌作用和抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(Humanimmunodeficiencyvirus1,HIV-1)活性外,还能失活HSV-1病毒颗粒,从而逆转病毒及其蛋白的病毒效应(致细胞病变)和抑制病毒蛋白质的合成。
从10份沈阳地区人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)血浆标本中提取核糖核酸(RNA),经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和套式聚合酶链反应(nest-PCR)扩增HIV-1的p17与p24交界部分的基因片断并进行测序。将所测序列与各亚型国际参考株及亚洲流行参考序列进行比对,确定被检标本的亚型,并进行基因序列分析。同时将所得亚型结果与经过亚型特异性引物的复合套氏PCR鉴定基因亚型的方法所获结果进行比较。结果表明,10份HIV-1病毒株分属B′、CRF07-BC和CRF01-AE3种基因亚型。本文所研究样本的p17区段的ks/ka值小于1,而p24区段的ks/ka值大于1;p24部分的基因同源性高于p17部分,即我国HIV-1B′、CRF07-BC和CRF01-AE3种亚型毒株的p17区段的基因变异较大,而p24区段相对较为保守。提示上述3种亚型HIV-1病毒株的p24区段更适合于HIV-1疫苗的研制。
用RT-PCR和免疫印迹的方法检测稳定表达NS4B的HeLa细胞中的XBP1;通过RT-PCR的方法在表达NS4B的HeLa和Huh-7细胞中检测ATF6,Grp78和caspase-12的转录,并且通过报告基因的方法分析XBP1和Grp78启动子活性。实验结果表明:在表达NS4B的HeLa细胞中检测到XBP1的两种形式(剪接和未剪接),此外,在细胞中ATF6、Grp78的转录水平和XBP1、Grp78启动子的荧光素酶活性较没有表达NS4B的HeLa和Huh-7细胞中的量有所增加;通过染色质免疫沉淀实验(ChIP)分析,这些增加可能是由于XBP1结合到了这些基因的启动子上引起的。总之,实验结果可提示HCVNS4B通过ATF6或XBP1途径引起内质网压力,导致UPR反应。NS4B可能在HCV的致病性中起着重要的作用,特别是在慢性肝炎,甚至肝细胞癌中。
将构建的携带FMDV衣壳蛋白P1-2A和蛋白酶3C编码基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗vUTAL3CP1以及编码FMDVP1-2A基因和猪IL-18基因的重组DNA疫苗pVIRIL18P1,分别以单独和混合的方式给豚鼠进行2次免疫,然后测定FMDV特异性结合抗体、中和抗体和T淋巴细胞增殖反应,并用250ID50的FMDV进行攻击,观察其保护效果。结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导豚鼠产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答。其中以vUTAL3CP1两次免疫组的效果最好,其诱导的抗体水平已接近于常规灭活疫苗,而细胞免疫水平则比后者高得多。攻击保护结果表明该组完全保护率可达3/4,而另外两组也具有一定保护效果。上述研究结果为进一步进行大动物免疫攻毒试验,并最终筛选出最佳疫苗和免疫程序奠定了基础。
根据鹅细小病毒(Gooseparvovirus,GPV)中国分离株HG5/82基因序列,设计引物,利用PCR技术扩增出HG5/82株vp2基因,将其克隆到pMD18-T载体后,转化入感受态细胞TG1中增殖。筛选阳性质粒,将其与原核表达载体pPROEXTMHTb分别用NcoI酶切后回收目的片断,进行定向连接,产物转化入感受态DH5α,重组质粒经酶切和测序证实目的基因正确克隆到表达载体的预期位点且插入方向正确,构建了含有HG5/82主要结构基因vp25’端969bp片段的原核表达载体。经IPTG诱导后表达出与预期大小相符的约36kDa的融合蛋白,表达形式为包涵体。薄层扫描结果表明表达产物约占菌体总蛋白的21.4%。包涵体通过6mol/L盐酸胍裂解后,利用镍离子亲和树脂进行纯化,用纯化的分子量为36kDa的融合蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗鹅细小病毒部分结构蛋白多克隆抗体。Westernblot分析表明该多克隆抗体与HG5/82毒株具有反应性,说明该融合蛋白具有抗原性。
设计带有BsmBI、BsaI或AarI酶切位点的引物,用RT-PCR扩增H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的8个基因全长片段,克隆入双向转录/表达载体pHW2000,并在PB2、PB1和NA基因中共引入了3个沉默突变标签。将其2个表面基因(HA和NA基因)加上任意1个内部基因,而其它5个内部基因来自A/WSN/33,进行了6种3+5组合形式的基因重排,把相应组合的转录/表达质粒共转染COS-1细胞,均产生了预期组合、有感染性的H9N2亚型流感病毒,表明亲缘关系遥远的流感病毒可以互相获取基因片段产生重组病毒,提示表面结构基因和单个内部基因不足以限制H9N2AIV在哺乳动物细胞上的宿主范围,同时也验证了构建的8个转录/表达载体均能有效工作,为进一步研究H9N2亚型AIV基因结构与功能、AIV与宿主之间的关系打下了基础。
通过接种鸡胚成纤维细胞(CEF)、间接免疫荧光试验(IFA)和聚合酶链式反应(PCR),连续五年从全国各地的送检病料中分离到14株J亚群白血病病毒(ALV-J)。为了动态观察ALV-J囊膜表面结构蛋白(GP85)的变异情况,对这14株野毒株的囊膜糖蛋白基因(env)进行了克隆和测序,将它们与HPRS-103株的GP85的氨基酸序列进行了比较,结果表明:ALV-J的囊膜表面结构蛋白发生了很大的变异,而且这些变异主要集中在高变区hr1、hr2和vr3;这些野毒株GP85的氨基酸序列的同源性在86.6%~100%之间(从同一鸡场中分离到的两株ALV-J即BJ00302与BJ0303的同源性为100%,其它毒株之间的同源性均小于100%);有义突变与沉默突变的比例显示这3个高变区极有可能是免疫选择压作用的位点。
选取3份DHBV阳性广东麻鸭血清提取DHBVDNA,设计一对扩增DHBV全基因序列引物Q1和Q2,扩增并克隆DHBV全基因序列,测序并运用相关计算机软件及方法分析获得的全基因序列。结果表明,广东麻鸭DH-BV全长为3027bp。提交GenBank后获得的收录号分别为:AY433937、AY521226、AY521227(来自1号血清);AY392760、AY536371(分别来自2、3号血清)。AY521227的PreS/SORF出现了单碱基突变,在PreC/CORF之前发现一个新的ORF,暂命名为HORF,HORF也同时存在于GenBank中储存的另外8个DHBV全基因序列中。系统发育分析表明,广东麻鸭DHBV在分化程度上是目前储存于GenBank中的DHBV全序列中最高的。成功克隆了广东麻鸭DHBV全基因序列,序列分析为进一步研究广东麻鸭DHBV提供了有益的信息。
本研究将Ⅰ型超强毒MDVMd11株的pp38和pp24完整基因分别克隆到真核双表达载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过间接免疫荧光试验(IFA)用单克隆抗体H19和鼠抗GST-pp24血清分别检测到了pp38和pp24基因的单独表达。然后将MDVMd11株的pp38和pp24完整基因同时克隆到载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过IFA检测和用抗pp24多克隆血清进行West-ern-blotting试验检测到了PP38和PP24磷蛋白的共表达。
本研究将鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)SD0210株经SPF鸡胚培育及鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养,获得了对CEF适应的细胞毒,并对细胞毒进行了致病性、回归动物的稳定性试验及免疫原性方面的试验,结果表明已成功获得了具有髙免疫原性且安全无毒力返强的致弱株,并初步揭示了vvIBDV在适应细胞、从超强毒力向弱毒力转化过程中,VP2高变区氨基酸序列的变化情况。SD0210株培养至18代开始适应细胞,出现细胞病变。21代细胞毒已对SPF鸡失去了致病性,在鸡体内连续传代15代毒力不返强,而且具有较高的免疫原性。
参照已发表的猪瘟病毒弱毒株的序列,设计7对覆盖全长基因组的引物,通过RT-PCR从感染猪瘟病毒弱毒株的PK-15细胞中扩增得到7个cDNA片段,分别克隆到pMD18-T载体并测序,利用DNASIS软件获得猪瘟病毒C81株全基因组序列(GenBank:AY663656)。C81株基因组全长12310nt,只有一个大的开放阅读框,编码3898个氨基酸的聚蛋白。序列分析表明,C81株开放阅读框与其它各毒株核苷酸和氨基酸序列的同源性变化较大,分别为84.4%~99.6%和91.6%~99.4%。同时,我们绘制了26株CSFVORF的进化树,比较了CSFV5’非翻译区核苷酸序列并推测其二级结构,发现不同毒株之间存在较大的差异,另外对C81株聚蛋白的功能域和三维结构进行了预测。
本文报道了基因工程棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV-AaIT)的外源蝎子毒素基因(AaIT)是否会向环境中的植物病原微生物或捕食性天敌转移的实验结果。首先,于实验室内将重组病毒HaSNPV-AaIT与棉花黄萎病病菌(VerticilliumdahliaeLleb.)进行了长达90d的混合培养,在混合培养30d,60d和90d后分别提取棉花黄萎病病菌的基因组DNA,用AaIT基因作探针进行点杂交,结果显示无阳性信号。另外,从多次施用过重组病毒的棉花田中采集了120只龟纹瓢虫和七星瓢虫,利用健康蚜虫饲养3-4d,用碱解液处理瓢虫体表后,从处理液中可以检测到病毒DNA;但瓢虫体表经碱解液和Dnase处理后,从瓢虫体内提取的基因组DNA,用PCR和斑点杂交的方法,都没有检测到AaIT的序列存在。本研究的实验结果说明,基因工程病毒的外源基因向其它生物转移的可能性极低。
从美洲棉铃虫细胞(HzAM1)中克隆了核糖体大亚基蛋白L13(RibosomalproteinL13,RpL13)的cDNA及其基因组DNA序列,并进行了序列分析。其编码框为666bp,无内含子,预测编码大小约为25kDa的蛋白。通过与其它15种动物的RpL13编码框序列进行进化分析,发现聚类结果与传统物种分类一致。转录研究表明,棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpaarmigerasinglenucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HaSNPV)感染HzAm1后使rpL13在细胞内的转录水平降低,在病毒感染后96h,rpL13mRNA的拷贝数降到对照健康细胞的8%。
根据已知的黄瓜花叶病毒,百合无症病毒、百合斑驳病毒基因核苷酸序列,设计引物和探针,制备寡核苷酸芯片。用Cy3标记核苷酸引物,不对称RT-PCR扩增产物与芯片上的寡核苷酸探针杂交,荧光扫描仪检测并分析信号。研究制备的基因芯片能够检测侵染百合的3种重要病毒核酸的特异性荧光信号,该项技术具有特异、灵敏、快速的优点。
烟草环斑病毒(Tobaccoringspotvirus,TRSV)是我国二类进境检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大。本研究依据TRSV外壳蛋白基因cp序列设计合成了2条引物,通过RT-PCR扩增得到长约1500bp的目的片段。将目的片段与质粒pET-22b(+)连接,构建了含TRSVcp基因的融合蛋白原核表达载体pETRSV-CP。序列分析表明,TRSV-SD1的cp基因全长1548bp,编码515个氨基酸与GenBank中其它TRSV分离物cp基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为90.7%~94.6%。将pETRSV-CP转入大肠杆菌,诱导表达。SDS-PAGE结果显示,表达的TRSVCP融合蛋白的相对分子质量约为58kDa。以此融合蛋白制备的抗血清的效价为1/1024,抗血清与TRSV具有良好的特异性反应。
Amplified HDV fragment by RT-PCR was cloned into T vector and PQE_{31} plasmid, which established a prokaryotic expression vector in E coli M_{15} The recombinant protein was purified by Ni-NTA column affinity chromatography, and identified by Western blot and ELISA: HDV antigen was expressed efficiently and had a well antigenicity character. It can be used in HDV clinical diagnosis and epidemiology survey.
Epidemiological characteristics of Hepatitis B virus in population in Xianning of Hubei province were investigated by ELISA, conventional PCR detection as well as specific genotyping system by PCR. Blood specimens were detected by ELISA and conventional PCR, the results indicated that 177(11.1%) of 1596 were HBV positive. Comparing with ELISA, conventional PCR is a sensitive, specific method for HBV DNA detection in serum. Positive serum specimens of 53 were identified and differentiated by specific genotyping system by PCR, the results demonstrated that HBV B genotype was found only in population in Xianning and that genotyping system based on PCR using type-specific primers could effectively differentiate HBV genotypes, indicating that this assay system is considered to be a useful tool for the molecular diagnosis of HBV and for large-scale survey of HBV.
The PCV-2 positive tissues by PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) were inoculated to the PK-15 cells not contaminated by PCV. The viral particles were observed in the infected PK-15 cells by eletronmicroscope .It was concluded that the isolate was PCV-2 and was named SCH-A strain.The capsid protein gene(cp) in ORF2 was amplified from PK-15 cell line infected with SCH-A strain by PCR, and was cloned and sequenced.The nucleotide sequences of ORF2 gene of the SCH-A strain was compared with other porcine circovirus isolates.The results showed that the homologies of nucleotides were between 90.5% and 96.7% in comparision with the PCV-2 reference strains,but the homologies of nucleotides were only about 67% with the PCV-1 reference strains. SCH-A strain displayed the highest nucleotide homology((96.7)%) with the reference strain Hunan .Phylogenetic tree analysis showed ORF2 gene of the SCH-A isolate belongs to PCV-2 .
The envelope glycoprotein (GP5) is one of the major structural proteins of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). In this report, the N-terminal hydrophobic sequence of envelope glycoprotein gene (orf5) was deleted by PCR. The gene was subcloned into prokaryotic expressing vector pET-28 a(+) , the recombinant plasmid named pET-GP5 was transformed into E.coli cell BL21. SDS-PAGE and Western-blot indicated that the orf5 gene was expressed successfully and the recombinant fusion protein, which was about 20.8kDa, had immunologically reactive activity. The studies lay foundations for further study on the development of vaccines for PRRSV.
39卷第1期 (2024年2月)
ISSN 1674-0769
EISSN 1995-820X
CN 42-1760/Q
主编: 石正丽
影响因子: 5.5*
*源于2022年JCR
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